Aislamiento, purificación y caracterización parciales de las proteasas obtenidas de hierba mora (Solanum nigrum) e higuerón (Ficus apollinaris)

Patricio Castillo, Rubén Félix, Marco Sinche, Ricardo Muñoz

Resumen


Resumen: En este trabajo se estudiaron algunas características de las proteasas presentes en muestras de hojas de hierba mora (Solanum nigrum) y de tallos de higuerón (Ficus apollinaris). Los extractos se trataron con etanol al 96% y luego fueron sometidos a la filtración en gel. Se realizó una electroforesis en condiciones desnaturalizantes con las fracciones más activas resultantes y una caracterización cinética en la que se determinaron los efectos de la temperatura, del pH y de la concentración de sustrato sobre su actividad caseinolítica. Finalmente, se determinó cualitativamente la presencia de alcaloides en los extractos crudos y en las fracciones purificadas más activas de ambas muestras. La filtración en gel tuvo un rendimiento del 72.9% en actividad caseinolítica para la hierba mora y del 16.4% para el higuerón. La electroforesis con las fracciones más activas de hierba mora presentó bandas proteicas entre 24 y 137 kDa, mientras que en las fracciones más activas de higuerón, se encontraron bandas con peso molecular entre 17 y 74 kDa. Cinéticamente, las fracciones más activas de hierba mora presentron una posible inhibición por exceso de sustrato, con valores de KM = 31.4 mol/L, KI = 58.5 mol/L y Vm´ax = 878.7 mUE/mL, a condiciones de pH y temperatura óptimas de 10.5 y 37 C; mientras que, las de higuerón se ajustron al modelo de Michaelis-Menten, con KM = 4.90 mol/L y Vm´ax = 87.3 UE/mL, a pH y temperatura óptimas de 8.5 y 45 C. Se reportó la presencia de alcaloides en ambas muestras, pero los procesos de purificación utilizados mostraron su efectividad en la eliminación de estas sustancias.

 

Abstract: The proteases obtained from hierba mora (Solanum nigrum) leaves and higueron (Ficus apollinaris) stems were studied. The extracts were treated with 96% ethanol and passed through a gel filtration column. An SDS PAGE was performed using the most active resulting fractions and a characterization of the effects of temperature, pH and substrate concentration on their caseinolytic activity. Finally, qualitative determinations of alkaloids presence in semi-purified extracts and in concentrated samples of the more active fractions were made. The total yield percentage, based on caseinolytic activity, for the gel-filtration was 72.95% for Solanum nigrum leaves and 16.44% for Ficus apollinaris stems. SDS PAGE showed proteic bands between 137 and 24 kDa, for Solanum nigrum, while Ficus apollinaris showed proteins with molecular weights between 74 and 17 kDa. In the kinetics characterization with casein as substrate, the more active fractions of Solanum nigrum samples evidenced an inhibition by substrate excess with KM = 31.4 mol/L, KI = 58.5 mol/L and Vmax = 878.7 mUE/mL at optimal conditions of temperature and pH (10.5 and 37 C). Ficus apollinaris samples followed the Michaelis-Menten kinetics model with KM = 4.90 mol/L and Vmax = 87.3 mUE/mL, also at optimal conditions (8.5 and 45 C). Alkaloid presence was positive for both samples, but the utilized purification processes permitted the elimination of these substances.


Citas


Bastidas, K., 2005. Estudio preliminar de la obtención de la enzima aminoacilasa I a partir de vísceras de cuy, pollo y res. Proyecto previo a la obtención del título de Ingeniera Química, E.P.N., Quito.

Chávez, M., Díaz, J., Pérez, U. y Delfín, J., 1990.Temas de Enzimología.Cuba, pp. 51, 52, 229, 230. [3] Coperland, R., 2000.Enzymes: A Practical Introduction to Structure, Mechanism, and Data Analysis.Wiley-VCH, Inc., pp. 266–304.

Corel Corporation, 2002.Corel Graphics Suite.U.S.A.

González, G., 1985. Métodos estadísticos y principios de diseño experimental. Segunda edición, Quito, pp. 95–104, 27–31, 117, 118.

Gómez, C., 2008. Identificación de actividad proteolítica en especies vegetales comunes presentes en las provincias de Loja y Pastaza. Proyecto previo a la obtención del título de Ingeniero Químico, E.P.N., Quito.

Grzonka, Z., Jankowska, E., Kasprzykowski, F., Kasprzy-Kowska, R., Lankiewicz, L.,Wiczk,W.,Wieczerzak, E., Ciarkowski, J., Drabik, P., Janowski, R., Maciej, K., Jaskólski, M. y Grubb, A., 2001. Structural studies of cysteine proteases and their inhibitors. Acta Biochimica Polonica 48, pp. 1–20.

Hauser, F., Strassner, J. y Schaller, A., 2001. Cloning, expression and characterization of tomato (Lycopersicon esculentum) aminopeptidase P*.The Journal of Biological Chemistry, Institute of Plant Sciences, Swiss Federal Institute of Technology Zürich, Suiza, pp. 1–30.

IIAP (Instituto de Investigaciones de la Amazonía Peruana), 2007. Oje o Higuerón. www.fao.org/AG/agL/agll/rla128/iiap/iiap2/CapituloIII-29.htm, Perú.

INVITROGEN, 2006. BenchMarkTMPre-Stained Protein Ladder. Catálogo No. 10748-010, California, U.S.A.

Lee, S. y Lim, K., 2005.Apoptosis induced by glycoprotein (150-kDa) isolated from Solanum nigrum L. is not related to intracellular reactive oxygen species (ROS) in HCT-116 cells. Cancer Chemother Pharmacol 57, pp. 507–516.

Marangoni, A., 2003. Enzyme kinetics, a modern approach. Wiley-Interscience, New Jersey, pp. 47–49, 52–58, 174–191.

Martínez, V., 2007. Solanum nigrum L., Hierba mora. El mundo de las plantas, www.botanical-online.com/medicinalssolanumcastella.htm, España.

MicrocalTM, 1999. Software Origin, versión 6.0. Microcal Software Inc. Northampton, U. S. A.

MILLIPORE, 2005. Amicon R Ultra-15, Centrifugal Filter Devices. Catálogo PR01780, Irlanda.

Novoa, I., 2005. Obtención de un sustituto vegetal de la renina para la elaboración de quesos. Proyecto previo a la obtención del título de Ingeniera Química, E.P.N., Quito.

Núñez, D., 2007. Identificación de proteasas vegetales con posibles aplicaciones industriales o bio-médicas a partir de especies comunes de las provincias de Bolívar y Pichincha. Proyecto previo a la obtención del título de Ingeniera Química, E.P.N, Quito.

Pierce, 2007. Inmobilized Ficin. http://www.piercenet.com/Products. U.S.A.

Rajesha, R., Natarajua, A., Gowdaa, C., Freyb, B., Freyb, F. y Vishwanatha, B., 2006. Purification and characterization of a 34-kDa, heat stable glycoprotein from Synade nium grantii latex: action on human fibrinogen and fibrin clot. Biochimie 88, Elsevier, India, pp. 1313–1322.

Salas, P., 2007. Estudio de un procedimento de extracción, puri-ficación parcial y caracterización cinética de bromelina obtenida a partir de tallos de piña (Ananas comosus) y análisis de su efectividad en el ablandamiento de las proteínas de la carne de res. Tesis de Ingeniería en Biotecnología, ESPE, Sangolquí.

Thacher, H., 1982. Manual de análisis orgánico cualitativo y cuantitativo. Segunda edición, Barcelona, pp. 236–237.


Texto completo: PDF

Refbacks

  • No hay Refbacks actualmente.


Creative Commons License
Este trabajo está licenciado bajo la licencia Creative Commons Attribution 3.0 .

El material presente en este sitio es de acceso abierto, es permitido su reproducción siempre y cuando se referencie a esta revista como su autor.