Aislamiento, purificación y caracterización parciales de las proteasas obtenidas de hierba mora (Solanum nigrum) e higuerón (Ficus apollinaris)

Resumen

Resumen: En este trabajo se estudiaron algunas características de las proteasas presentes en muestras de hojas de hierba mora (Solanum nigrum) y de tallos de higuerón (Ficus apollinaris). Los extractos se trataron con etanol al 96% y luego fueron sometidos a la filtración en gel. Se realizó una electroforesis en condiciones desnaturalizantes con las fracciones más activas resultantes y una caracterización cinética en la que se determinaron los efectos de la temperatura, del pH y de la concentración de sustrato sobre su actividad caseinolítica. Finalmente, se determinó cualitativamente la presencia de alcaloides en los extractos crudos y en las fracciones purificadas más activas de ambas muestras. La filtración en gel tuvo un rendimiento del 72.9% en actividad caseinolítica para la hierba mora y del 16.4% para el higuerón. La electroforesis con las fracciones más activas de hierba mora presentó bandas proteicas entre 24 y 137 kDa, mientras que en las fracciones más activas de higuerón, se encontraron bandas con peso molecular entre 17 y 74 kDa. Cinéticamente, las fracciones más activas de hierba mora presentron una posible inhibición por exceso de sustrato, con valores de KM = 31.4 mol/L, KI = 58.5 mol/L y Vm´ax = 878.7 mUE/mL, a condiciones de pH y temperatura óptimas de 10.5 y 37 C; mientras que, las de higuerón se ajustron al modelo de Michaelis-Menten, con KM = 4.90 mol/L y Vm´ax = 87.3 UE/mL, a pH y temperatura óptimas de 8.5 y 45 C. Se reportó la presencia de alcaloides en ambas muestras, pero los procesos de purificación utilizados mostraron su efectividad en la eliminación de estas sustancias.

 

Abstract: The proteases obtained from hierba mora (Solanum nigrum) leaves and higueron (Ficus apollinaris) stems were studied. The extracts were treated with 96% ethanol and passed through a gel filtration column. An SDS PAGE was performed using the most active resulting fractions and a characterization of the effects of temperature, pH and substrate concentration on their caseinolytic activity. Finally, qualitative determinations of alkaloids presence in semi-purified extracts and in concentrated samples of the more active fractions were made. The total yield percentage, based on caseinolytic activity, for the gel-filtration was 72.95% for Solanum nigrum leaves and 16.44% for Ficus apollinaris stems. SDS PAGE showed proteic bands between 137 and 24 kDa, for Solanum nigrum, while Ficus apollinaris showed proteins with molecular weights between 74 and 17 kDa. In the kinetics characterization with casein as substrate, the more active fractions of Solanum nigrum samples evidenced an inhibition by substrate excess with KM = 31.4 mol/L, KI = 58.5 mol/L and Vmax = 878.7 mUE/mL at optimal conditions of temperature and pH (10.5 and 37 C). Ficus apollinaris samples followed the Michaelis-Menten kinetics model with KM = 4.90 mol/L and Vmax = 87.3 mUE/mL, also at optimal conditions (8.5 and 45 C). Alkaloid presence was positive for both samples, but the utilized purification processes permitted the elimination of these substances.